根据临床表现与实验室检查结果间接推论作出诊断。典型的多发性硬化症病例通常根据临床征象就能有把握确定诊断。在首次发作后只能怀疑为MS。到后来，病史中有反复的缓解与复发，再加上中枢神经系统内散在于多个区域的多发病变的临床证据，则高度提示为MS。但也必须考虑其他的一些可能性。
MRI是诊断多发性硬化症最为敏感的脑成像技术，可显示多发的脱髓鞘斑块。它也可以显示延髓与脊髓交界处一些可以治疗的非脱髓鞘性病变，这些病变可偶尔引起不定的而且波动的运动和感觉症状谱，钆增强的MRI可区分急性炎症区域和陈旧的脑部斑块。
CT造影剂增强的CT扫描也能显示多发性硬化症病变；加倍碘剂的用量并延迟扫描的时间("加倍剂量延迟性CT扫描")可提高病灶的发现率。
在大部分多发性硬化症的症状病例中脑脊液都有异常。IgG可＞13%，淋巴细胞计数与蛋白含量可稍有增高，但这些变化都非疾病特征性。在高达90%的MS病例中，脑脊液琼脂凝胶电泳显示出少克隆带，提示在脑内有IgG的合成，但是少克隆带不出现也不能排除MS。IgG的水平与疾病的严重程度有联系。在急性脱髓鞘过程中，脑脊液中髓磷脂碱性蛋白可有增高。 诱发电位是感觉系统受到刺激后在脑部的电位反应记录。在多发性硬化症的症状早期，模式转换视觉诱发电位，脑干听觉诱发电位，与体感诱发电位均有异常的延迟，因为脱髓鞘能使这些感觉通路中的电冲动传导减慢。
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