急性病毒性脑膜炎的诊断主要依靠临床表现和脑脊液化验检查，在排除其他病原因子所致的脑膜炎，特别是有积极治疗手段的脑膜炎后可以得出。病毒性脑膜炎必须鉴别的情况有细菌性脑膜炎的早期，治疗不完全的细菌性脑膜炎，蛛网膜下腔出血，其他原因的无菌性脑膜炎，结核性脑膜炎，真菌性脑膜炎，寄生虫脑膜炎，新生物和胶原疾病等。
脑脊液中病毒抗原的分析，诸如乳酸盐，溶菌酶（lysozyme或muramide），C-反应蛋白，肌酸磷酸激酶等检查都不敏感到足以区分病毒和细菌性脑膜炎；其他检查如血常规，血液化学检查和脑电图偶然可发现异常，但亦无特殊性。如遇鉴别困难的脑膜感染，目前没有简单易行，且具有百分之百的阳性或阴性价值的手段能将病毒和细菌性脑膜炎区别开来。正确的诊断还要靠详细的病史，体俭和脑脊液检查，特别是多次复查的结果，并按病情的进展过程随时修改诊断。
绝大多数病毒性脑膜炎实际上没有必要作出确切病原诊断，因为其为良性自限性病程，治疗上只需对症治疗，不需要用抗生素。若为确定病原，可以从脑脊液分离病毒； 急性期和恢复期血清标平的血清中检查和检出脑脊液中的IgM抗体或病毒抗原。近年应用免疫和DNA探针扩充技术，如多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PRC）检出抗原有一定前途，但目前还不能广泛用于临床。
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